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PROTOCOL OF PCR-SEQUENCE |
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PCR |
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| PREMIX |
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| PCR sol |
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vol.per reaction(ul) |
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x100 |
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final |
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| <10xPCR Gold Buffer |
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1 |
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100 |
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1X |
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| <2mM each 4 dNTP mix |
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1 |
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100 |
|
0.2mM |
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| <25mM MgCl2* |
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0.8 |
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80 |
|
2mM |
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| <DMSO |
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0.5 |
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50 |
|
5% |
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| <10uM each F & B primer |
|
0.25 |
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|
25 |
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| <AmliTaqGold |
|
0.05 |
|
|
5 |
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| <H2O |
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5.4 |
|
|
540 |
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| subtoal |
|
9 |
|
|
900 |
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| <50-20ng/ul template DNA |
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1 |
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| total Vol |
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10 |
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1000 |
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| *Mg濃度は1.5-4mM (1.5mM: 0.6ul, 2mM: 0.8ul, 2.5mM: 1ul,
3mM: 1.2ml, 3.5mM: 1.4ul, 4mM: 1.6ul) |
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| 95℃, 9min |
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| 45X (95℃, 15sec→55-65℃*, 20sec→ 72℃, 30sec-1min**) |
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| 72℃, 7' |
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| 4℃ store |
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| *optimaization時は予想温度前後±5℃でふる ** product
size次第(1kb=1min) |
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CLEAN UP |
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| PREMIX |
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| Exo1-SAP sol |
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vol.per reaction(ul) |
|
x100(sample) |
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| <H2O |
|
3.475 |
|
|
347.5 |
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|
| <SAP(1unit/ul)Roche |
|
0.5 |
|
|
50 |
|
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|
| <Exo1(20unit/ul)NEB |
|
0.025 |
|
|
2.5 |
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|
| tatal volume |
|
4 |
|
|
400 |
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| PCR product |
|
2 |
|
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| tatal volume |
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6 |
|
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|
| incuvating 37℃ 60min |
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| inactivate 80℃ 15min |
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| dillusion to 12ul (+H2O) |
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6 |
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|
| total |
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12 |
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SEAQUENCE, ET Terminator、1/8希釈 |
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| PREMIX |
|
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| CYCLE SEQUENCE |
|
vol.per reaction(ul) |
|
X200 |
|
final |
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|
| <DMSO |
|
0.5 |
|
|
100 |
|
5% |
|
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|
| <H2O |
|
0.3 |
|
|
60 |
|
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|
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|
| <ET terminator mix |
|
1 |
|
|
200 |
|
4倍 |
|
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| < 50mM Tris-HCl(pH=8.3) |
|
3 |
|
|
600 |
|
|
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|
| < 25mM MgCl2 |
|
1.2 |
|
|
240 |
|
3mM |
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|
| total
volume |
|
6 |
|
|
1200 |
|
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|
| <2.5uM primer* |
|
1 |
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|
| <template PCR** |
|
3 |
|
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|
| total |
|
10 |
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| *50uM primer 2ul+H2O 38ul |
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| **templateの必要量はPCR
productの場合10-20ng
(PCR終了後2ul泳動し量を見積もることーここでは最初の産物の0.5ul分を使用することになる) |
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|
ET terminatorではテンプレートの純度が高くないとかかりにくく、テンプレート量としては多めのが良い |
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| 95℃ のHot Startは必要ない（高温に弱いのでしない方が良いらしい） |
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| 25-30X (95℃, 20sec→50℃, 15sec→ 60℃, 1min) |
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|
| 4℃ store |
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| マルチスクリーン96ウェルプレートの使用方法 |
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Dye teeminator removal |
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| 2 |
SephadexG-50*をよく振って、沈殿しているものを再浮遊させて300μl/1穴いれる |
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| 3 |
マルチスクリーンプレートの下に、廃液用のプレートをセットする |
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| 4 |
遠心機に、プレートごとセットし、2233rpm**で5分遠心する |
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| 5 |
マルチスクリーンプレートの下の廃液用のプレートを、サンプル収集用のプレートにかえる |
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| 6 |
ゲルの真ん中に、サンプルをすべて（10μl***）静かにのせる |
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| 7 |
遠心機に、プレートごとセットし、2233rpmで5分遠心する |
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収集用のプレートに落ちた液体をシークエンスに使用する |
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マルチスクリーンプレートは一度使用した穴以外の部分は使えますので、すべての穴を使い切るまで、繰り返し使用できます |
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使用した穴は、各自Ｘを打って使ったことが分かるようにしてください |
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使用する穴は、左上からは８レーンずつ使うとき、右下からは数個ずつ使うとき使用してください（ただし、この点は各自やりよいようにしてください） |
| *Sepahdec G-50 superfine |
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| **2233rpm＝910ｇ＠Beckman GH18.3 rotor |
ミリQ50mlにSephadex G-50 superfineを3gの割合で混合し、オートクレーブにかける |
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| ***水を10ul加えてから２度に分けてのせた方が安全か？ |
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| 溶出液（場合によっては総量50ulにmess up) を直接使用。アプライ前の熱変性は不要 |
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| 長期間保存する場合は遮光して-20℃ |
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