| cell line |
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| ステップ |
問題項目 |
問題点 |
解決方法（信州） |
コメント |
（本） |
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| 単核球分離 |
赤血球の混入 |
採血して4日くらい経つ場合など、遠心しても分離がきれいに出来ず、赤血球が混ざる |
2回までフィコールによる分離を繰り返す |
2回以上はやってもそれ以上の改善は望めないので2回までで良い |
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赤血球が混じっても良いからしっかりと単核球の部分をとる |
赤血球を入れないようにとるのを控えるとその後の増えが良くない |
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メディウムチェンジを繰り返す内に次第に赤い色は薄まっていく |
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白い層の採取 |
ピペットで壁にへばりついてるのもしっかりこすりとる |
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扱い方 |
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メディウムを入れた後は、ピペットでしっかりピペッティングして混ぜ合わせる |
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その後1週間は静置し、決して手をかけない！！ |
この間何度も除くとかえってうまくいかなくなる |
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| 継代 |
目安 |
培養液の色は？細胞数としてどれくらいのかず？ |
細胞数と言うより、培養液の色の変化で判断*1 |
変化がなくても必ず週に2回はメディウムチェンジを行うこと！！これをしないと細胞はどんどん弱っていく！！ |
2X106/ml=6-7/小さい四角、になれば継代が必要 |
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色の変色が少ないときは？ |
細胞の状態を確認し、メディウムチェンジ*1 |
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期間 |
細胞が増えてこないときどれくらい待つか？ |
2ヶ月が目安!! |
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増えないときは？ |
全く変化なければ採血をしなおす。 |
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少し濁ってきている時検鏡して、細胞が全体に少ないだけなら継代を少量でし*2、 |
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死んだ細胞が多いならフィコールによる再分離をする*3 |
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最長で何ヶ月まで継代するか？ |
2ヶ月半まで継代してもしっかり増えてこなければ、採血をし直す |
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培養液 |
10%と20%はどう使い分けるのがよいか？ |
分離後1回目は20%で、後はメディウムの色の変化があれば10%でよい |
20%でも悪いわけではないが10%で十分であり、もったいないとのこと |
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培養の途中で色の変化が乏しくなっていったときには20%にする |
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入れ替える量（培養液の色が黄色の時） |
約半量を取り除き、培養液の濁りが目でみえて、色がオレンジ色になる量までくわえる |
目で確認しながら加えていく！！薄くなりすぎるのは良くない |
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入れ替える量（培養液の色がオレンジで濁っていない時） |
約半量を除き、当量かもしくは1.5mlを加える |
培養液の量は増やさない方がいい！！出来るだけ底面積が少ない方が増えやすい！！混濁が出てくるまでほぼ5mlで継代を繰り返す |
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扱い方 |
メディウムチェンジの直後の扱い |
メディウムチェンジ後、ふたをしてフラスコをよく振って細胞をほぐす（蓋、口の部分に培養液をつけないように注意！！コンタミンの原因になる！！） |
固まりがなく均一になっていた方が増えが良い。細胞が浮遊していれば新しいピペットでピペッティングしてほぐす！！ |
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| 細胞の染色 |
染色液 |
0.25%トリパンブルーを1/2になるように加える |
あらかじめ、等量を加えるように調整しておく*4 |
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| 凍結保存 |
保存時期 |
どの様な状態で保存するか？ |
培養液が黄色になりtotal12-15mlになったとき*5 |
このとき、はじめはうまく凍結保存できても2回目から継代がうまく行かなくなることもある |
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おおよそ何ヶ月目か？ |
1ヶ月半から2ヶ月目から開始し、5回目の凍結保存が終わるのが3-4ヶ月目になる |
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染色して死んだ細胞がいるときは？ |
フィコールで再度細胞を分離*3し、継代し直す |
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保存方法 |
どれくらいの濃度が良いか？ |
黄色になった培養液10mlをセルバンカー1mlで保存する |
凍結保存時の濃度が高いほど、再融解時に早く細胞が起きてくる |
2-5X106/mlになるようにする |
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| 再融解 |
温度 |
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37℃で素早く溶かすこと |
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