| check項目 |
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起こりうる問題 |
解決方法、対処方法 |
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| 電源 |
電源の入れ方、切り方 |
機会が壊れる。 |
テスタロッサ:本体につけたシールの順番にあわせて、電源を入れる。モデナ:本体の下から電源を入れる。 |
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電源の切り方 |
機会が壊れる。 |
どちらも入れるときと逆の順番で電源を切る。 |
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| バッファー |
バッファーの量 |
機会のエラーでバッファーが流れっぱなしになる場合がある。 |
夜間WAVEをかけておくときは数サンプルを流す場合でも、必ず、一晩流れ続けても問題ないバッファーの量があるかを確認する。 |
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バッファーの作り方 |
非常に微妙で、少しの違いがピークに影響する。 |
特に、BとAバッファーは慎重に作ること。特にBのアセトニトリルの量が重要!! |
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| ランプ |
ランプのつけておく期間 |
長期間使用しないときは消さないとドンドンランプの寿命が短くなる。 |
2日以上使わない場合は、ランプを消す。土曜の夜に使用されていない場合、鈴木が消しますので、月曜日に使うときはcheckしてください。ただし、逆に頻回につけたり消したりするのも良くないので注意!! |
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| 使用前のcheck |
ランプのcheck |
ランプがついていないと解析出来ない。 |
使用前にはランプが着いていることを確認する。 |
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C WASH |
airが混入して解析がうまくいかない? |
使用前に"WASH"をして側面のシリンジにairがないことを確認してください。 |
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バッファー表示の確認 |
Dが100だと、直前に洗浄した状態なのでこのまま解析すると平衡化がされていない。 |
カラムにとってはD bufferで充填された状態のが良いので、使う直前にA50%,B50%で約30分間平衡化する。 |
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| 解析上 |
ログ表に記入して使用する!! |
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サンプルのcheck |
バッファー(バッファーは結構高額)と時間が無駄になる。 |
PCRがうまくいっているか必ず電気泳動で確認してからWAVEを使用する。 |
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sequence配列の入力 |
これが違っていると正確なピークの位置を割り出せない=ピークが立たない。 |
解析したいPCR産物のsequence配列を入力する。Forward primerの始まりから、back primerの終わりまで!! |
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WAVEのシステムでmelting tem.のcheck |
しっかり設定しないと、全体をきちんと解析することが出来ない=見落としやすくなる。 |
SEQの全領域が70%くらいの領域を含むように温度をいくつか選択する |
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条件設定 |
airなどの影響で小さなピークがretation time3前後にでるので、ピークを3前後でたてると、解析するときに変異なのかアーチファクトなのかが分かりにくい。その結果、seqで無用な確認をすることとなる。 |
ピークがretation time5前後に立つように調整する。但し、中には5前後でピークをたてると、ピークがダルになり、かえってわかりにくくなる場合がある。その時はどちらが見やすいかで選択する。 |
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ピークがきれいに立つか条件設定の段階で確認 |
最初からピークが一本でないものは結局うまく解析できない=無駄になるだけ!! |
最初の条件設定でピークが一本にならないモノは、seqを確認する。seqがうまく読めないモノはこれで解析しても結局分からない!!primer setを作り直すのがよい。 |
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空うちをする |
設定した条件であわせておいても、いきなりサンプルを流すと、最初の3つほどはピークの位置がずれる。 |
最初の3発ほどは、機会の特性上どうしても、本来の位置よりも後方にずれたりするので、injectionのvolumeを0にして3回ほど空うちしてから(サンプルを置かずに得ってはダメ!!機会が止まってしまう!!サンプルはセットした状態でinjectionのvolumeを0とする)本来のサンプルを打つようにする。 |
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ピークを確認をする |
条件設定であわせても、その時のバッファーの微妙な違いなどのためにピークの位置がずれることがある。 |
必ず、自分の目で96サンプルの最初の2つ程を確認すること!! |
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PCR産物 |
必要最低量で!! |
dead volumeが約5ulいるので、必要量+5ulとして計算する。 |
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コンピューターのフォルダー |
”C”フォルダーでデーターを入れると、”C”が一杯になったときにWAVEが動かなくなる!! |
フォルダーが”D”であることを必ず確認する。 |
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バッファーの量の確認 |
機会のエラーでバッファーが流れっぱなしになる場合がある。 |
夜間WAVEをかけておくときは数サンプルを流す場合でも、必ず、一晩流れ続けても問題ないバッファーの量があるかを確認する。 |
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途中でWAVEが止まったとき |
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必ずエラーログを印刷してから、再起動する!!印刷物はエラーログのファイルに挟んでおく。 |
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| メンテナンス |
カラムのメンテナンス |
しっかり行わないとドンドン劣化する!! |
96サンプル使用後(続けてする場合はそれが終了してからで良いです)は80℃,Dバッファー100%,1.5ml/minで約30分洗浄する。 |
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カラムのメンテナンス |
しっかり行わないとドンドン劣化する!! |
時々、カラムの方向を変える方が良いが、カラムの方向を変えるとピークの形が変わる可能性がある。条件設定をまとめてした場合は、それが終わるまではカラムの方向は変えない方が無難。但し、ずっと変えない分けにはいかないので、しばらく使用していない場合は、鈴木が方向を変えます。使用前にログをcheckしてください。 |
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カラムによい条件 |
しっかり行わないとドンドン劣化する!! |
バッファーが流れていないときは、Dバッファーでカラムを満たしておくのが一番カラムに優しい!!使用後は少しでも良いので、Dバッファー100%で流しておく。 |
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カラムを1週間以上使用しない時 |
カラムは使わない場合はWAVEにつけたままだと、カラムが乾いて劣化が進む!! |
1週間以上つかわない場合はカラムは取り外すこと。 |
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| 結果の扱い |
偽陽性の確認 |
PCR上のミスリーディングによる場合がある。 |
見つかったヘテロが1,2個のみである場合は、PCR上のミスリーディングによる場合が結構ある。この場合はもう一度そのサンプルをPCRし直して、WAVEにかけて再現性を確認する。再現性があればsequenceをして最終確認をする。この過程を省くと、偽陽性の除外が難しい。ただし、ヘテロが10%以上も認められる場合は必要ない。 |
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偽陰性の確認 |
見落とすのはもったいない!! |
ピークにわずかな”肩”としてしか見られないモノもある。疑わしい場合は、再現性を見てからseqする。このとき、ピークがどの位置に立っているかが非常に重要となる。Retation time3前後だと、アーチファクトか、本物かが分からなくなる。このため、ピークの位置は5前後に持っていくのが無難。 |
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偽陰性の確認 |
見落とすのはもったいない!! |
WAVE上10%以上ヘテロと思われる ピークがあるにもかかわらず、seq ではヘテロを感知できないモノがある。この場合は、クローニングした上でseqを確認するのが重要!! |
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