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DNA isolation |
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| cell lysis |
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EDTA 2Na採血管で7ml採血…………凍結保存しておいたサンプルは、白血球の融解とDNaseの活性を抑えるために37℃で素早く溶かす。 |
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但し30'以上37℃におくと、白血球融解を増やし、抽出量が減ってしまう。 |
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8000g=2150rpm 10' RT遠心 |
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buffy coat+RBCを50mlチューブに移す |
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3XVolume(21ml)のRBC Lysis solutionを加え、ゆっくりinvertする……十分に混ぜないと赤血球融解が十分なされない。 |
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10'RTでおく |
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2000g=3500rpm 10'遠心 |
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上清をすてペレットを残す…………………200-400μｌの上清は残しておくこと |
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十分にvortexする……………………………ここで十分にかたまりをvortexすることが、効果的な細胞融解を行うキーポイント！！ |
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7mlのcell lysis solutionを加えピペッテジングする……RT以下にするとdetergentが析出するのでよくない |
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もし、固まりがあれば37℃で溶かしても良いが、37℃でO/NするとDNAが劣化する！！ |
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RTであればこの状態のままで少なくとも18ヶ月は問題ない |
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| Rnase Treatment |
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35μｌのRnase
A solutionを加える |
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チューブを25回invertして混ぜる |
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37℃15'………………………………………60'以上置くと、DNAが劣化するので注意！！ |
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| Protein Precipitation |
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……PPSを加えた状態で長い間おいておくとDNAが劣化するので注意 |
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サンプルがRTになるまでまつ |
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2.33mlのProtein Precipitation Solutionを加える |
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最強で20''vortexをかける |
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2000g=3500rpm 10' ＲＴ 遠心 |
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最強で20''vortexをかける |
……………この手順は2回繰り返した方が除蛋白がしっかり出来る。 |
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on ice 5' |
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2000g=3500rpm 10' ＲＴ 遠心………このペレットは蛋白が沈殿したもの！上清にDNAがある！！ |
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| DNA Precipitation |
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あらかじめ50mlチューブに100%イソプロパノールを7ml入れておき、そこに上清を入れる……冷やすとクロスコンタミネーションをおこし、抽出量をへらす！！ |
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50回ゆっくりInvertする……………………4'ほどゆっくり回転させればよい。DNAが白い糸のように見えてくる。 |
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2000g=3500rpm ３' 遠心 |
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上清を捨て、キムワイプの上にチューブをふせる |
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すぐに7mlの70%エタノールを加え、ゆっくり数回Inverする……Naを除くにはRTのがよい。手早く注意して行わないとDNAが流れていってしまう！！ |
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2000g=3500rpm 1' 遠心 |
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上清を捨て、キムワイプの上にチューブをふせる………エタノールが壁に残るようならば、吸引して取り除くこと！！エタノールが残っているとPCRでトラブルとなる |
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15'以上放置するとDNA hydration solutionに溶けにくくなる！！ |
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| DNA hydration |
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583μｌのDNA hydration solutionを加える…………233μgのDNAがとれるとすると、400ng/μlとなるはず |
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RTでO/N………………………………………………………65℃1hrでも良いが2hr以上置くとDNAが劣化する |
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軽く遠心し、液を1.5mlチューブにいれる |
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| DNA |
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DNA hydration solutionに溶かしたものは4℃で少なくとも8年は安定 |
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水に溶かすと不安定 |
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DNAは短期間なら、凍結融解を繰り返すのは良くないので4℃での保存がよい |
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DNAは長期間の保存なら、-20〜-80℃で凍結しておくと蒸発を減らせる |
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DNAの濃度測定 |
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| A260 |
DNA,RNAの濃度 |
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| A280 |
蛋白の濃度 |
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| A320 |
その他の濃度 |
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| A260/A280 |
1.75以上ないと精製度が良くない＝ＰＣＲがかかりにくくなる。酵素の切れも悪くなる |
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| A320 |
この値が以上に高いとA260/A280が問題なくてもPCR,酵素反応がうまくいかない |
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この2つの値が大きく狂うときは何らかの操作上の問題が発生している可能性が強いので、すぐに何らかの対応が必要です！！ |
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そのままの状況で抽出を続けないように！！何が問題かを先に解決するように！！ |
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| BeckmanによるDNAの濃度は0.00の値まで信頼でき、0.000の値が若干ぶれる |
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| Beckmanで測定するときは最低70-80μｌのサンプル量で測定すること！これより少ない量だと測定が正確に出来ない可能性がでてくる |
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| BeckmanのUVの寿命は750時間（約2年）であり、それを超すと測定が不安定になりうる |
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